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      1. 不同霉菌毒素對豬和鼠卵子毒性作用的比較研究

        時間:2020-05-27    點擊:402

        陸玉潔1,張悅1,劉佳倩1,鄒鵬1,賈璐1,蘇永騰2,孫育榮2,孫少琛1 

        1. 南京農業大學動物科技學院,南京            2. 江蘇奧邁生物科技有限公司,南京


        摘要

         

        研究背景:黃曲霉毒素B1(AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、HT-2毒素、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEA),這些毒素是玉米飼料中最常見的霉菌毒素,并且對動物和人類有多重毒性作用。以前的研究中可知霉菌毒素會損傷哺乳動物卵母細胞的質量,而且這些毒素對動物卵母細胞的有效濃度是不同的。

        試驗方法:本研究旨在比較小鼠和豬卵母細胞對AFB 1、DON、HT-2、OTAZEA的敏感性。我們以小鼠和豬卵母細胞的極體排出率為標準,研究霉菌毒素對卵母細胞成熟的影響。

        實驗結果與討論:結果表明,10μM AFB11μMDON對豬卵母細胞成熟的影響顯著高于50μMAFB12μMDON對小鼠卵母細胞的影響。然而,與50nMHT-2對豬卵母細胞的影響相比,10nMHT-2對小鼠卵母細胞成熟的影響更加顯著。另外,5μMOTA10μMZEA對豬卵母細胞的成熟有顯著影響,而對小鼠卵母細胞成熟的影響濃度分別為300μM50μM。我們的結果表明,除了HT-2毒素之外,豬卵母細胞對AFB1、DON、OTAZEA的敏感性高于小鼠卵母細胞。

         

        關鍵詞:卵母細胞、減數分裂、霉菌毒素、豬、小鼠

         

        一 引言

            菌毒素是真菌或霉菌代謝產生的次生代謝產物,黃曲霉毒素(AF)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、T-2、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEA)是目前已知的最常見的霉菌毒素。這些霉菌毒素會以非常小的劑量對人體和動物的健康產生毒性作用,現已經引起了全世界的關注。

            黃曲霉毒素是玉米飼料中廣泛存在的霉菌毒素。黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性和致癌作用使它成為最重要的黃曲霉毒素,它可引起DNA損傷,氧化應激,凋亡等多種影響,而在豬卵母細胞中,AFB1可影響細胞周期并引起氧化應激。

            脫氧雪腐鐮刀菌烯醇主要由真菌產生,是玉米、小麥和大麥等谷物中最常見的污染物。用被DON污染的飼料飼喂家畜家禽之后,它會存在于在雞蛋,牛奶,肉里面。在動物體內,它會引起器官損傷和肝臟脂質積聚,嘔吐、厭食、生長遲緩、免疫毒性以及生殖和發育能力受損。在細胞和分子水平上,DON可以誘導細胞凋亡,氧化應激與遺傳毒性,另外,以往的研究表明DON對豬卵母細胞的紡錘體形態有影響。

            HT-2是T-2的主要代謝產物,它們屬于A類單端孢霉烯族毒素。HT-2會引起多種影響,包括抑制蛋白質、DNA和RNA的合成,以及氧化應激;降低生殖能力。

        OTA可以由赭曲霉,炭疽菌A.,黑曲霉,疣青霉等真菌產生。OTA對家畜有毒性,其主要靶器官是腎臟。OTA可以引起免疫毒性、肝中毒、凋亡、細胞活力下降,還可以影響小鼠卵母細胞成熟與胚胎發育。

          ZEA是由鐮孢霉菌產生的一種霉菌毒素,在結構上類似于雌二醇,它和雌二醇競爭與雌激素的受體結合,從而導致生殖障礙。ZEA的遺傳毒性也已經被證實,它會導致DNA斷裂、凋亡和細胞周期的中斷。幾項研究表明,ZEA降低了豬卵母細胞的發育能力。

            在以前的研究報告中提到,霉菌毒素的幾個組成部分損害哺乳動物卵母細胞的質量,但是在不同動物模型的卵母細胞中,有不同的有效濃度。雖然AFB1、DON、HT-2、OTA和ZEA均有體內代謝產物,但這些霉菌毒素均在卵巢中檢測到,說明除其代謝產物外,AFB1、DON、HT-2、OTA和ZEA還可直接影響卵巢功能。本研究旨在比較小鼠和豬的卵母細胞對AFB1、DON、HT-2、OTA和ZEA的敏感性,為今后霉菌毒素的研究提供基礎數據。我們采用小鼠和豬卵母細胞的極體排出率作為霉菌毒素對卵母細胞成熟的毒性效應的標準,結果表明除HT-2外,豬卵母細胞對AFB1、DON、OTA和ZEA的敏感性高于小鼠卵母細胞。

        二 實驗材料和方法

        1.試劑

            AFB1,DON,HT-2,OTA,和ZEA來自J&K化學試劑公司(中國上海)。TCM-199來自GIBCO(Life Technologies,美國)。TCM-199其中含有75μg/ml青霉素,50μg/ml鏈霉素,0.5μg/ml促卵泡素,0.5μg/ml促黃體素,10ng/ml表皮生長因子,用于卵母細胞成熟。M2和M16培養液購自Sigma(Merck; St. 美國).

        2.卵母細胞采集和培養

            我們遵循南京農業大學動物研究所委員會的指導方針(SYXK-Su-20170007),取3-5周齡ICR小鼠的生發泡-完整卵母細胞在M2培養基中,M16培養液覆蓋石蠟進行培養,將小鼠卵母細胞置于37℃,5%CO2溶液中12h,觀察極體排出情況。

        杜洛克豬的卵巢是在當地豐永食品業的屠宰場購買的。屠宰后,將卵巢放在裝有0.9%生理鹽水的保溫瓶中,然后在2小時內送到實驗室。保溫瓶的溫度接近38℃。取10ml一次性注射器抽取卵丘卵母細胞復合體(COCs),然后將卵母細胞置于38.5℃,5%CO2培養44h,觀察卵母細胞極體排出情況。

        3.毒素處理

            AFB1,DON,HT-2,OTA和ZEA溶于DMSO中,濃儲配制成50mM,然后用TCM199或M16成熟培養液稀釋成不同濃度。將GV期的卵母細胞與這些霉菌毒素共同培養,對照組加入等量的DMSO,用極體排出率分析卵母細胞的成熟率。

        4. 數據分析

            數據以平均數表示(n=3),濃度曲線圖是由GraphPad Prism 5制作。每次分析至少使用三次重復實驗的數據,每次重復是在不同的時間通過一個獨立的實驗完成的。結果為平均值±SEM,兩組數據進行T檢驗,p值<0.05為顯著。

        三 結果

        1. AFB1對小鼠和豬卵母細胞成熟的影響

           我們首先觀察了AFB1對小鼠和豬卵母細胞的影響,用10、50、100和150μM的AFB1培養小鼠卵母細胞12h,對照組的平均極體排出率為79.94±4.3%(n=142)(Fig. 1A)。與對照組相比,10μMAFB1培養的卵母細胞極體排出率無顯著性差異(72.82±4.83%,n=110,p>0.05)。當AFB1濃度增加到50μM(55.96±4.77%,n=157,p<0.001),100μM(17.86±7.51%,n=154,p<0.05),150μM(2.15±2.15%,n=146,p<0.001)時,卵母細胞排極體率明顯減少。

        豬卵母細胞在濃度為5、10、50、100μM的AFB1培養基中培養44h。對照組極體排出率為80.72±7.05%(n=217),接近小鼠對照組卵母細胞的成熟率,但隨著AFB1濃度的增加,豬卵母細胞極體排出率降低。豬卵母細胞經5μMAFB1培養后與對照組卵母細胞比較,無顯著差異(68.34±15.39%,n=195,80.72±7.05%,n=217,p>0.05),而10μM(53.02±7.12%,n=144,p<0.001)50μM(22.95±6.76%,n=192,p<0.01),100μM(0±0%, n=147, p<0.01)的AFB1處理組,卵母細胞成熟率則顯著降低(Fig. 1B)。

        我們還分析了在相同濃度的AFB1處理下小鼠組和豬組,豬卵母細胞極體排出率低于小鼠卵母細胞。如圖Fig.1C所示,小鼠和豬卵母細胞的對照組之間無顯著差異(p>0.05),而在10μM(p<0.05)和50μM(p<0.01)的濃度下,豬卵母細胞的排極體率顯著低于小鼠卵母細胞(p<0.01),表明豬卵母細胞對AFB1的敏感性高于小鼠卵母細胞。

         

         

        Figure 1 AFB1對卵母細胞成熟的影響(A)小鼠卵母細胞經AFB1處理后極體排出率。用濃度為0, 10, 50、100, 150μM的AFB1培養小鼠卵母細胞12 h。(B)用濃度為0、5、10、50、100μM的AFB1培養44h的豬卵母細胞極體排出情況。隨著濃度的增加,小鼠和的豬卵母細胞的極體排出率均降低。(C)在相同濃度的AFB1下對小鼠和豬卵母細胞影響的統計分析。灰色線代表鼠卵母細胞極體排出率,黑線代表豬卵母細胞極體排出率。*,顯著,P<0.05;**,顯著,P<0.01;***,顯著,P<0.001。

         

        2. DON對小鼠和豬卵母細胞成熟的影響

            我們接著觀察了DON對小鼠和豬的卵母細胞的影響,用1、2、3和4μM濃度的DON分別培養小鼠卵母細胞12h,結果表明DON影響小鼠卵母細胞成熟。小鼠對照組的平均極體排出率為76.73±3.24%(n=162)(Fig. 2A),1μMAFB1培養的小鼠卵母細胞與對照組比較無顯著性差異(76.01±2.35%n=139,p>0.05)。2μMDON處理(44.38±4.87%,n=173,p<0.001),3μMDON處理(16.30±4.00%,n=199,p<0.001),4μMDON處理(2.28±0.69%,n=189,p<0.001)的小鼠卵母細胞與對照組相比極體排出率顯著降低。

            豬卵母細胞在0.5、1、2、3μM濃度的DON中培養44h,其對照組極體排出率為72.05±2.6%(n=195),與小鼠卵母細胞對照組極體排出率相近,0.5μM的DON(68.42±4.55%,n=159,p>0.05)處理組與對照組相比,無顯著性差異(P>0.05)。1μMDON處理(46.29±3.89%,n=176,p<0.001),2μMDON處理(17.02±4.87%,n=145,p<0.01),3μMDON處理(3.29±1.81%,n=132,p<0.001)與對照組相比,豬卵母細胞極體排出率明顯降低(Fig. 2B)。

        為了比較小鼠和豬卵母細胞對DON的敏感性,我們還分析了在1μM(p<0.001)、2μM(p<0.01)、3μM(p<0.01)DON的相同濃度下小鼠組和豬組的極體排出情況,小鼠卵母細胞和豬卵母細胞的極體排出率有顯著性差異(P<0.01)(Fig. 2C)。表明與小鼠卵母細胞相比,豬卵母細胞對DON更敏感。

         

         

        Figure 2 DON對卵母細胞成熟的影響A)DON處理后小鼠卵母細胞的排極體率,DON濃度為0,1,2,3,4μM,卵母細胞排極體率隨著濃度的增減呈遞減趨勢(B)用濃度為0,0.5,1,2,3μM的DON處理豬卵母細胞,卵母細胞排極體率隨著濃度的增減呈遞減趨勢。(C)

        相同濃度的DON對小鼠和豬卵母細胞影響的統計分析;疑代表鼠卵母細胞極體排出率,黑線代表豬卵母細胞極體排出率。*,顯著,P<0.05;**,顯著,P<0.01;***,顯著,P<0.001。

         

        3. HT-2對小鼠和豬卵母細胞成熟的影響

            觀察HT-2對小鼠和豬的卵母細胞的影響,用10、20、30和40nM的HT-2培養小鼠卵母細胞12h,對照組的平均極體排出率為73.08±1.67%(n=153)(Fig. 3A)。然而10 nMHT-2處理(43.33±4.93%,n=176,p<0.05),20 nMHT-2處理(33.05±2.18%,n=163,p<0.001),30nMHT-2處理(7.08±0.89%,n=150,p<0.001),40nMHT-2處理(1.05±0.10%,n=169,p<0.001)的極體排出率與對照組相比是顯著降低的。

           將豬卵母細胞在10、50、100、150、200和400nM的HT-2中培養44h,與小鼠卵母細胞相似,我們發現HT-2對豬卵母細胞的成熟有影響。豬卵母細胞對照組的極體排出率為78.19±2.03%(n=171),接近小鼠對照組的極體排出率。除10nMHT-2處理組(68.67±2.99%,n=163,p>0.05)外,50nMHT-2處理(47.4±3.36%,n=156,p<0.01)、100nMHT-2處理(25.50±5.14%,n=164,p<0.01)、150nM HT-2處理(21.22±4.07%,n=188,p<0.01)、200nMHT-2處理(18.02±6.69%,n=175,p<0.01),400nMHT-2處理(8.22±0.78%,n=162,p<0.001)的豬卵母細胞極體排出率均顯著降低(Fig. 3B)。

        小鼠和豬對照組的卵母細胞極體排出率相似,但在10nM的DON濃度下,小鼠和豬的排極體率有明顯差異(p<0.01)(Fig. 3C)。實驗結果表明,在相同濃度的HT-2處理下,小鼠卵母細胞極體排出率低于豬卵母細胞,說明小鼠卵母細胞對HT-2毒素的敏感性高于豬卵母細胞。

         

         

        Figure 3 HT-2對卵母細胞成熟的影響。A)濃度為0,10,20,30,40nM的HT-2處理小鼠卵母細胞,隨著HT-2濃度的遞增卵母細胞排極體率遞減。(B)濃度0,10,50,100,150,200,400nM的HT-2處理豬的卵母細胞,隨著HT-2濃度的遞增卵母細胞排極體率遞減(C)相同濃度的HT-2對小鼠和豬卵母細胞影響的統計分析;疑代表鼠卵母細胞極體排出率,黑線代表豬卵母細胞極體排出率。*,顯著,P<0.05;**,顯著,P<0.01;***,顯著,P<0.001。

         

        4. OTA對小鼠和豬卵母細胞成熟的影響

            我們接著觀察了OTA對小鼠和豬的卵母細胞的影響,用200、300、400和600μM的OTA處理培養小鼠卵母細胞12h,其對照組的平均極體排出率為80.23±3.87%(n=169) (Fig. 4A)。200μM的OTA濃度與對照組比較無顯著性差異(73.77±2.24%,n=143,P>0.05),然而300μM的OTA處理(49.86±4.29%,n=190,p<0.01)、400μM的OTA處理(31.23±3.64%,n=145,p<0.01)、600μM的OTA處理(2.22±2.22%,n=178,p<0.01),卵母細胞極體排出率明顯減少。

        豬卵母細胞在1、5、10、30、100μM的OTA中培養44h,與小鼠卵母細胞相似,對照組與1μM的OTA處理組比較差異無顯著性(80.34±7.95%n=164,65.46±4.09%,n=178,p>0.05)。而5μM的 OTA處理組(53.83±0.34%,n=154,p<0.05),10μM的OTA處理組(22.26±3.14%,n=183,p<0.05),30μM的OTA處理組(22.19±4.87%,140,p<0.01),100μM的OTA處理組(4.24±3.93%,n=144,p<0.01)卵母細胞排極體率顯著降低(Fig. 4B)。

          在相同濃度的OTA處理下,豬卵母細胞極體排出率低于小鼠卵母細胞(Fig. 4C),表明豬卵母細胞對OTA的敏感性高于小鼠卵母細胞。

         

         

        Figure 4 OTA對卵母細胞成熟的影響A)OTA處理后小鼠的卵母細胞極體排出率。OTA濃度為0,200,300,400,600μM。(B)OTA處理后豬卵母細胞極體排出率。OTA濃度為0,1,5,10,30,100μM。(C)相同濃度的OTA對小鼠和豬卵母細胞影響的統計分析;疑代表鼠卵母細胞極體排出率,黑線代表豬卵母細胞極體排出率。*,顯著,P<0.05;**,顯著,P<0.01;***,顯著,P<0.001。

         

        5. ZEA對小鼠和豬卵母細胞成熟的影響

            最后觀察ZEA對小鼠和豬卵母細胞的影響,用10、50、100和200μM的ZEA處理,培養小鼠卵母細胞12h。對照組平均極體排出率為81.29±6.06%(n=155)(Fig. 5A),當ZEA濃度為10μM時,MII卵母細胞所占比率為74.52±4.92%(n=154),與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。而50μMZEA處理組(54.35±3.9%,n=128,p<0.05),100μMZEA處理組(26.23±8.00%,n=150,p<0.05),200μMZEA處理組(0.00±0.00%,n=132,P<0.01),小鼠卵母細胞極體排出率顯著降低。

            對于豬卵母細胞來看,對照組的平均極體排出率為77.85±9.51%(n=175),5μM的ZEA處理組(60.45±1.65%,n=199,p>0.05)與對照組相比無顯著性差異,但10μM的ZEA處理組(51.42±2.73%, n=190,p<0.05),30μM的ZEA 處理組(19.10±4.49%, n=147,p<0.05) 和50μM的ZEA 處理組(4.08±4.08%,n= 148,p<0.01)豬卵母細胞極體排出率明顯降低(Fig. 5B)。

        實驗結果表明,在相同濃度的ZEA處理下,豬卵母細胞極體排出率低于小鼠卵母細胞,小鼠和豬卵母細胞對照組差異不顯著(p>0.001),但在10μM和50μM時,小鼠卵母細胞與豬卵母細胞之間有顯著性差異(p<0.001)(Fig. 5C),表明豬卵母細胞對ZEA的敏感性高于小鼠卵母細胞。

         

        Figure 5 ZEA對卵母細胞成熟的影響A)ZEA處理后小鼠卵母細胞排極體情況。ZEA濃度為10,50,100,200μM。(B)ZEA處理后豬卵母細胞排極體情況。ZEA濃度為5,10,30,50μM.(C)相同濃度的ZEA對小鼠和豬卵母細胞影響的統計分析;疑代表鼠卵母細胞極體排出率,黑線代表豬卵母細胞極體排出率。*,顯著,P<0.05;**,顯著,P<0.01;***,顯著,P<0.001。

         

        四 討論

        本研究以極體排出率作為卵母細胞成熟的標準,比較了小鼠和豬的卵母細胞對AFB1、DON、HT-2、OTA和ZEA的敏感性,為毒素的后續研究提供了基礎數據庫。

        霉菌毒素對人和動物的健康有多方面的影響,如免疫系統、微生物等。近年來,大量報道了霉菌毒素對生殖系統的毒性,尤其是對卵母細胞和精子的毒性。我們以前的工作發現,在豬的卵母細胞中,50μM的AFB1影響COCs的生長,尤其是極體排出明顯減少,并且10μM的AFB1可增加小鼠精子DNA片段化的比例。結果表明,即使在生殖系統中,不同細胞類型或動物模型對霉菌毒素的敏感性也不同,10μM的AFB1對豬卵母細胞成熟的影響大于50μM的AFB1在小鼠卵母細胞中的作用。

        以前的研究表明,2μMDON對小鼠卵母細胞減數分裂中紡錘體的形成有影響。而最近的一項研究表明,10μM的DON會影響豬卵巢的形態。我們最近的研究顯示,3μM的DON處理改變了豬卵母細胞的自噬/凋亡和表觀遺傳修飾。本研究結果還表明,1μM的DON對豬卵母細胞成熟有影響,而在小鼠卵母細胞中為2μM的DON處理表現出與其相似的敏感性。HT-2與AFB 1和DON有不同的敏感性,HT-2毒素對小鼠卵母細胞的細胞骨架動力學、凋亡/自噬、氧化應激和表觀遺傳修飾有影響。我們的結果表明,10nM的HT-2影響小鼠卵母細胞成熟,而相似的的結果發生在50nM的 HT-2處理豬卵母細胞,另外還需要進一步研究HT-2毒素在不同生殖細胞類型如卵丘細胞和精子中的毒性作用。

        我們的結果表明,50μM的OTA影響豬卵母細胞的成熟,而在小鼠卵母細胞中300μM的OTA影響卵母細胞成熟。影響體內外模型小鼠卵母細胞的OTA濃度差異很大,有待進一步研究。對于ZEA來說,在30μM的濃度下,ZEA通過氧化應激、自噬和早期凋亡對豬卵母細胞的成熟和胚胎發育產生影響;而對小鼠卵母細胞來說,它通過改變表觀遺傳修飾水平來影響卵母細胞質量。實驗結果表明,10μM的ZEA對豬卵母細胞成熟的的影響大于50μM的ZEA對小鼠卵母細胞成熟的影響,與AFB 1和DON有相似的濃度模式。

        五 結論

           綜上所述,我們的實驗結果表明,這5種霉菌毒素均影響小鼠和豬卵母細胞的質量,但小鼠和豬卵母細胞對毒素的敏感性不同。除了HT-2毒素外,豬卵母細胞對AFB1,DON,OTA,ZEA的敏感性高于小鼠卵母細胞。本研究結果為哺乳動物卵母細胞的進一步研究提供了基礎數據庫。



         

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